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Jun 19, 2023

Optimierung der industriellen (3000 L) Produktion von Bacillus subtilis CW

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 11153 (2022) Diesen Artikel zitieren 8853 Zugriffe 12 Zitate 14 Altmetric Metrics Details Ein kommerzielles pflanzliches probiotisches Produkt wurde unter Verwendung entwickelt

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11153 (2022) Diesen Artikel zitieren

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12 Zitate

14 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Ein kommerzielles probiotisches Pflanzenprodukt wurde unter Verwendung von Bacillus subtilis CW-S in submerser Fermentation entwickelt. Mit dem Ziel einer kostengünstigen Herstellung wurden die Auswirkungen von Melasse und Harnstoff auf das Zellwachstum untersucht. Plackett-Burman und Central-Composite Design (CCD) wurden genutzt, um die Produktionsparameter zu optimieren und die Produktivität zu maximieren. Bewertet wurden die Stabilität des formulierten Produkts und seine Wirksamkeit beim Anbau von Miniknollen in der Aeroponik und bei Kartoffeln in Industriequalität auf dem Feld. Die Ergebnisse zeigten, dass das Medium BS10 (Melasse und Harnstoff) eine zufriedenstellende Zelldichte (7,19 × 108 KBE/ml) im Vergleich zu den Kontrollmedien (1,51 × 107 KBE/ml) und BS1-BS9 (teuer) (1,84 × 107–) erzeugte. 1,37 × 109 KBE/ml). Den validierten CCD-Ergebnissen zufolge passten die optimierten Parameter gut in Pilot- (300 L; 2,05 × 109 KBE/ml) und industrielle (3000 L; 2,01 × 109 KBE/ml) Bioreaktoren, was zu einer Verdoppelung der Zellkonzentration im Vergleich zum Labor führte (9,84 × 108 KBE/ml) Bioreaktoren. In der Aeroponik erzielte CW-S hervorragende Ergebnisse mit einer deutlichen Steigerung der Menge und des Gewichts der Miniknollen sowie der Überlebensrate der transplantierten Pflänzchen. In einem Feldversuch konnte der Ertrag von Industriekartoffeln (> 55 mm) durch eine Reduzierung der Düngerdosis gesteigert werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass CW-S unter Verwendung der neu entwickelten Medien und optimierten Bedingungen kommerziell hergestellt werden kann, wodurch Pflanzenprobiotika kostengünstiger und für Landwirte für den Pflanzenanbau, insbesondere in der aeroponischen Miniknollen- und Kartoffelproduktion in Industriequalität, zugänglicher werden.

Der Begriff „pflanzliche probiotische Bakterien“ wurde erstmals von Haas und Keel für Bakterien geprägt, die drei Schlüsseleigenschaften besitzen, die zu einem besseren Pflanzenschutz beitragen: (i) die Fähigkeit, in ihren Wirten eine induzierte systemische Resistenz (ISR) auszulösen, (ii) Wirksamkeit und Konkurrenzfähigkeit bei der Nischenbesiedlung und (iii) das Vorhandensein direkter antagonistischer Merkmale gegenüber Krankheitserregern1. Pflanzenprobiotika sind mikrobielle Kulturen, die das Pflanzenwachstum und/oder die Biokontrolle durch eine Vielzahl von Aktivitäten wie Phosphatlösung, Stickstofffixierung, Siderophorproduktion und verbesserte Pflanzenimmunität gegen verschiedene durch Phytopathogene verursachte Krankheiten fördern2,3. Bacillus subtilis verbessert als pflanzliches Probiotikum die Nährstofflöslichkeit, beschleunigt die Nährstoffaufnahme im Boden und wirkt als pflanzenwachstumsförderndes Bakterium (PGPB). Es kann auch Stickstoff binden, indem es das nifH-Gen4 exprimiert. Es handelt sich um ein nicht pathogenes Bakterium, das häufig als Modellorganismus für die Produktion von Sekundärmetaboliten verwendet wird. Die Food and Drug Administration (FDA) hat B. subtilis zusammen mit anderen Bacillus-Arten als GRAS-Organismus (Generally Recognized As Safe) eingestuft. Bacillus subtilis verbessert die Bodenstruktur, indem es Bodenpartikel durch extrazelluläre Metabolitensekretion miteinander verbindet, fördert den Abbau von komplexem organischem Material sowie unlöslichen Nährstoffen in einfachere Formen, die von Pflanzen leicht aufgenommen werden können, verbessert ihr Wachstum und induziert Widerstandsfähigkeit gegen Stress und Krankheiten2, 5.

In letzter Zeit besteht großes Interesse an pflanzlichen Probiotika. Einige Bacillus spp. haben das Potenzial, pflanzliche Probiotika zu sein und können in großem Maßstab angebaut werden6. Schlechte Bodenbedingungen, widrige klimatische Bedingungen, extreme Temperaturen und Dürre, traditionelle landwirtschaftliche Praktiken und mangelnde technologische Entwicklung haben die Pflanzenproduktivität in der nördlichen Region Bangladeschs erheblich beeinträchtigt7. In den letzten Jahren hat die Betonung der grünen Landwirtschaft und der Produktion hochwertiger Pflanzen zu einem Wandel bei den agrochemischen Inputs geführt8. Die Suche nach ökonomischen und ökologisch sicheren Lösungen, die das Wachstum und den Ertrag von Pflanzen steigern, hat zum Einsatz von Biodüngern als Alternative zu Agrochemikalien geführt9. In entwickelten Ländern sind Produkte auf Bazillusbasis weit verbreitet. Alinit, der erste kommerziell erhältliche Bakteriendünger, enthält Bacillus spp. Dies führte zu einer Steigerung der Ernteerträge um 40 %. Zu den auf Bacillus spp. basierenden Pflanzenverbesserungsprodukten gehören Kodiak (Bacillus subtilis GB03), Quantum-400 (Bacillus subtilis GB03) und YIB (Bacillus subtilis QST713). Biodünger auf Bacillus-Basis sind aktiver als andere Bakteriendünger, da Bacillus spp. in kommerziellen Formulierungen weisen aufgrund einer effizienteren Metabolitenproduktion und Sporenbildungsfähigkeiten eine höhere Lebensfähigkeit der Zellen auf10.

Die Herstellungskosten mikrobieller Produkte werden ein entscheidender Faktor sein, wenn sie aufgrund der Knappheit an Rohstoffressourcen und einer optimierten industriellen Produktionsmethode in weniger entwickelten Ländern gefördert werden sollen. Die Zellkonzentration jedes nativen Stammes von Bacillus spp. ist anders. Dies liegt an ihren Ernährungsbedürfnissen und kulturellen Bedingungen. Eine praktische Möglichkeit, die Herstellungskosten zu senken, besteht darin, die Kulturzeit zu optimieren, kostengünstige Medien zu verwenden und die Produktionsparameter zu optimieren, um eine höhere Zellkonzentration zu erreichen. Die gebräuchlichste und effizienteste Methode zur Gewinnung erheblicher Mengen an Biomasse sind kostengünstige Produkte und Nebenprodukte. Durch die Minimierung von Industrieabfällen und die Bereitstellung eines zweiten Lebens und Werts für diese Produkte trägt dieses abfallbasierte Wachstumsmedium für Mikroorganismen zur Bioökonomie bei11. Die Inhaltsstoffe eines Mediums müssen die Grundvoraussetzungen für das Zellwachstum enthalten und außerdem ausreichend Energie für den Stoffwechsel bereitstellen und Zellüberleben. In den meisten Fällen ist die Stickstoff- und Kohlenstoffversorgung unerlässlich. Stickstoffquellen können anorganisch (wie in Ammonium- und Nitratsalzen) oder organisch (wie Aminosäuren, Proteine ​​oder Harnstoff) sein. Zucker wie Saccharose und Fruktose sowie industrielle Nebenprodukte wie Melasse sind häufige Kohlenstoffquellen12. Bei der industriellen Produktion fallen erhebliche Betriebskosten an, wodurch sich der Produktpreis erhöht13,14.

Statistische Forschungsmethoden wie Plackett-Burman und Response Surface Methodology (RSM) können alle Einflussparameter gleichzeitig optimieren und so die Einschränkungen eines Einzelfaktor-Optimierungsverfahrens umgehen15. Das Plackett-Burman-Design (PBD) ist ein schneller und praktischer Ansatz zum Auffinden der kritischen Komponenten, der Zeit spart und sicherstellt, dass jeder Parameter genau definiert ist16. RSM wird verwendet, um den Einfluss mehrerer Faktoren zu untersuchen, die sich auf Reaktionen auswirken, indem diese gleichzeitig geändert und eine Reihe von Experimenten mit CCD17 durchgeführt werden. PBD und RSM haben einige Bioprozesse effektiv optimiert18,19. In jüngster Zeit haben verschiedene Forscher statistisch optimierte Prozessdesigns von B. subtilis für die Produktion verschiedener Enzyme und Metaboliten veröffentlicht20,21. Allerdings sind die Daten zur industriellen Produktion von Bacillus subtilis als pflanzliches Probiotikum noch begrenzt.

Bangladesch ist der siebtgrößte Kartoffelproduzent der Welt. Die jährliche Gesamtproduktion beträgt fast 10,21 Millionen Tonnen22. Kartoffeln sind ein beliebtes Lebensmittel mit hohem Verzehr, da sie reich an Kohlenhydraten, Fett, Ballaststoffen und wichtigen Mikronährstoffen wie Kalium, Salz und Carotinoiden sind23. Menschen konsumieren Kartoffeln auf unterschiedliche Weise: gekocht oder gebraten, in verarbeiteten Lebensmitteln wie Chips, Pommes Frites, Pulver und Kartoffel-Dal. Kartoffeln werden nach ihrem Verwendungszweck sortiert. Als Saatgut werden Kartoffeln kleinerer Größe verwendet, in der Industrie kommen größere Kartoffeln zum Einsatz. Pflanzkartoffeln müssen frei von Viren sein, große Augen haben und ein hohes Ertragspotenzial haben. Industriekartoffeln müssen eine hohe relative Dichte und einen geringen Gehalt an reduzierendem Zucker und Phenol aufweisen. Viele Studien haben gezeigt, dass verschiedene Parameter wie Bodentyp, Düngemittelanwendung, Pflanz- und Erntetermine sowie genetische Faktoren die Produktion von Kartoffelknollen und ihre äußeren und inneren Eigenschaften beeinflussen24. Die Feldwirtschaft ist sowohl biotischen als auch abiotischen Risiken und Unsicherheiten ausgesetzt, wie z. B. starken Winden, Überschwemmungen, Dürren und Schädlingsbefall. Das Aeroponik-System wird heute häufig zum Anbau von Miniknollen für die Kartoffelsamenproduktion eingesetzt. Pflanzenwurzeln in einem aeroponischen System haben einen besseren Zugang zu Umgebungsgasen wie Sauerstoff, wodurch sie schneller und vorhersehbarer wachsen können. Diese geschlossenen Systeme erfordern weniger Bewässerung als im Boden angebaute Pflanzen. Die Nährstoffe können recycelt werden, da sie im Wasser gelöst sind. Abgesehen von diesen Vorteilen trägt auch die Möglichkeit, eine große Anzahl von Pflanzen auf kleinem Raum zu produzieren, zur Umweltfreundlichkeit der Aeroponik bei25.

In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die kostengünstige industrielle Produktion eines sehr wirksamen pflanzlichen probiotischen Impfmittels für Landwirte, das aus dem einheimischen Stamm Bacillus subtilis CW-S entwickelt wurde, sowie auf die neuartigen Anwendungen des Produkts, wie z. B. aeroponische Miniknollen und Kartoffeln in Industriequalität Produktion.

CW-S-Zellen waren stäbchenförmig und produzierten ovale Endosporen. Sie waren grampositiv und ergaben einen positiven VP-Test, aber einen negativen MR-Test. CW-S war auch positiv für Stärkehydrolyse, Katalase und Citrataktivität und wurde in NA-Medien mit 7,0 % NaCl bei 45–50 °C gezüchtet. Sie waren in der Lage, Mannitol zu fermentieren, was durch die Entwicklung eines gelben Farbtons im Bacillus-Differenzierungsagar angezeigt wurde. Das Isolat CW-S wurde mutmaßlich als B. subtilis identifiziert. Die biochemischen Tests, die Koloniemorphologie und die mikroskopischen Beobachtungen sind in der Ergänzungstabelle T1 bzw. der Ergänzungsabbildung F1 zusammengefasst. Die DNA-Ähnlichkeit wurde mithilfe des NCBI BLAST-Dienstes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) bestimmt. Die Sequenz wies eine 100 %ige Abfrageabdeckung und 100 % Identität mit dem ribosomalen RNA-Gen des Bacillus subtilis-Stamms DK15 16S, einer Teilsequenz und einer vollständigen Sequenz auf. Die NCBI-Referenzsequenz war MT534533.1. Die Sequenznummer MW819960.1 wurde der Sequenz zugewiesen, als sie in der GenBank-Datenbank hinterlegt wurde. Der phylogenetische Baum zeigte (ergänzende Abbildung F2), dass die typische Sequenz des Bacillus subtilis-Stammes in der aktuellen Untersuchung zur gleichen Gruppe gehörte wie die Sequenzen des Bacillus subtilis aus der Genbank, was die Stammidentifizierung bestätigte.

Das Potenzial von CW-S, Stickstoff aus der Umgebung zu binden, wurde durch Wachstum im Nfb-Medium bestätigt, wie in der ergänzenden Abbildung F3 dargestellt. In einer quantitativen Analyse zeigte CW-S eine P-Solubilisierungsaktivität (10,22 ppm) und produzierte IAA (05,342 g/ml) in einem mit Tryptophan ergänzten Nährmedium.

CW-S hemmte Phytopathogene effizient auf PDA-Medien. CW-S hatte die stärkste antagonistische Aktivität gegen Curvularia spicifera ApexBLR4 (69,9 ± 3,81 %) und Alternaria alternata ApexALT10 (68,1 ± 4,71). Die geringste Hemmung wurde gegen Lasiodiplodia theobromae ApexRHZ5K18 (51,6 ± 4,24) und Fusarium equiseti ApexPTR3 (53,7 ± 3,67) beobachtet, während eine mäßige Hemmung gegen Sclerotium delphinii Apex_SCR5 (63,5 ± 4,04) festgestellt wurde.

Tabelle 1 vergleicht die Auswirkungen des CW-S-Stammes (T1) auf Weizenkeimlinge mit der Kontrolle (T0). Den Daten zufolge waren alle vegetativen Wachstumsparameter bei den behandelten Sämlingen höher als bei den Kontrollsämlingen. Die Impfmittel hatten keinen negativen Einfluss auf die Blattzahl, die Anzahl der Triebe, den Blattdurchmesser, die Sprosshöhe, die Wurzellänge sowie das Frisch- und Trockengewicht der Sämlinge. Die Inokulation der Sämlinge führte zu einer Zunahme der Blätter um 18,33 %, der Triebe um 50 %, des Blattdurchmessers um 20,06 %, der Pflanzenhöhe um 9,10 %, der Wurzellänge um 54,114 % und des Frischgewichts um 61,83 %. Folglich erhöhte sich das Trockengewicht der Weizenkeimlinge im Vergleich zur Kontrolle um 55,0 %. Abschließend wurde festgestellt, dass CW-S wachstumsfördernde Wirkungen auf Pflanzen hat.

Unter den elf verschiedenen Medien, die zur Kultivierung von Bacillus subtilis CW-S in submerser Kultur verwendet wurden, ergab BS1 die höchste Zellkonzentration. Die zweithöchsten Zellkonzentrationen wurden in BS6, BS10 und BS5 erhalten, die alle nahezu vergleichbar waren. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der Wachstumsmedienbewertung. In allen nachfolgenden Studien wurde CW-S auf einem BS10-Medium gezüchtet, das Melasse und Harnstoff enthielt, da die Zellkonzentration und die Ergebnisse der Pflanzenanalyse zufriedenstellend waren.

Medienauswertung anhand der Zellkonzentration von CW-S.

Der erwartete Gesamtkohlenhydratgehalt von Melasse liegt bei 50 ± 2 %26. Dieses Sortiment entspricht dem Industriestandard für die wirtschaftliche Produktion von Bacillus subtilis. Der Prozentsatz der Gesamtkohlenhydrate in der gesammelten Melasseprobe betrug 57 mg/ml, also durchschnittlich 57 % (m/m). Dieser Prozentsatz war für die Produktion von Bacillus subtilis CW-S sehr gut geeignet.

Wie in Tabelle 2 gezeigt, gab es eine erhebliche Variation in der Zellkonzentration des Stammes CW-S in PBD. Die Zellkonzentration lag zwischen 2,8 × 108 und 7,68 × 108 (KBE/ml). Die Variation weist darauf hin, dass der Prozess optimiert werden muss, um die Zellkonzentration des Stamms CW-S zu erhöhen. Vier Faktoren, nämlich Temperatur, pH-Wert, Inkubationszeit und Bewegung, wurden als die stärksten Einflussfaktoren auf die Zellkonzentration identifiziert, mit entsprechenden p-Werten von weniger als 0,005, was darauf hindeutet, dass sie signifikant waren. Die übrigen Faktoren, nämlich Belüftung, Inokulumgröße, Prozentsatz der Kohlenstoffquelle und Prozentsatz der Stickstoffquelle, zeigten p-Werte (0,1) über dem Signifikanzwert, was bedeutet, dass sie nicht signifikant waren. Tabelle 3 zeigt die Haupteffekte der unabhängigen Faktoren und der Varianzanalyse (ANOVA), des Regressionskoeffizienten, der F-Werte und der P-Werte für die in dieser Studie untersuchten Faktoren. Mit einem Bestimmtheitsmaß (R2) von 98 % konnte eine Zellkonzentrationsvariabilität von bis zu 98 % abgeschätzt werden. Der vorgegebene R2 (0,98) lag ziemlich nahe am angepassten R2 (0,9267). Der F-Wert des Modells von 18,40 für die Zellkonzentration lässt darauf schließen, dass sie signifikant war. Der Wahrscheinlichkeitswert wurde verwendet, um die Bedeutung jedes unabhängigen Faktors abzuschätzen. Somit zeigte ein p-Wert von 0,018, dass das Modell signifikant war. Pareto-Diagramme der standardisierten Effekte für Reaktionen sind in Abb. 2 dargestellt. Temperatur, pH-Wert, Inkubationsdauer und Bewegung wurden durch ANOVA-Ergebnisse als kritische unabhängige Faktoren identifiziert und für weitere Untersuchungen durch CCD berücksichtigt. Als Funktion unabhängiger Faktoren ergibt sich das Polynom erster Ordnung Gl. (1) Die Expression der Zellkonzentration von B. subtilis CW-S wurde wie folgt abgeleitet:

wobei Y die Reaktion ist (Zellkonzentration, KBE/ml); A, B, C, D, E, F, G und H sind die unabhängigen Faktoren für Bewegung, Belüftung, Inokulumgröße, Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Inkubationszeit, pH-Wert und Temperatur mit ihren jeweiligen Koeffizienten.

Pareto-Diagramm der standardisierten Effekte für die Zellkonzentration von CW–S.

RSM mit CCD wurde verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen vier kritischen Variablen zu untersuchen. Die im CCD verwendeten realen und codierten Werte sind in Tabelle 7 aufgeführt. Das CCD wurde in den experimentellen Versuchen verwendet, wie in der Ergänzungstabelle T2 dargestellt. Laut Modellzusammenfassung (Ergänzungstabelle T3) waren die linearen, 2FI- und kubischen Modelle für diese Reaktion nicht geeignet. Das angepasste R2, die vorhergesagten R2-Werte und die fehlenden Anpassungstests zeigten auch, dass alle Modelle außer quadratisch nicht für diese Antwort geeignet waren (Ergänzungstabelle T4). Daher wurde das quadratische Modell verwendet, um die Beziehung zwischen Zellkonzentration und unabhängigen Variablen zu charakterisieren. Das Polynom zweiter Ordnung Gl. (2) wurde mithilfe einer multiplen Regressionsanalyse ermittelt:

Dabei steht Y für die Zellkonzentrationsreaktion, während A, B, C und D jeweils für Temperatur, Inkubationszeit, pH-Wert und durch Bewegung kodierte Werte stehen.

Die Analyse der Varianz des quadratischen Regressionsmodells (Tabelle 4) zeigte, dass das Modell hochsignifikant war, wie durch den Fisher-F-Test (Fmodel = 539,72) und einen niedrigen Wahrscheinlichkeitswert (Pmodel < 0,0001) belegt. Auch das quadratische Modell passte gut zu den Daten, wie der p-Wert für „fehlende Anpassung“ (0,2481) zeigt. A, B, C, D, AC, AD, BC, BD, CD, A2, B2, C2 und D2 waren die wichtigen Modellbegriffe in diesem Modell. Der R2-Wert des Modells betrug 0,9980, was darauf hinweist, dass es zuverlässig war. Um das Zusammenspiel unabhängiger Faktoren besser zu verstehen, wurden 3D-Reaktionsoberflächen erstellt. Abbildung 3a–f zeigt die Reaktionsflächen, die für die Variation der Zellkonzentration als Funktion der Werte zweier Variablen generiert werden, wobei die anderen beiden Variablen auf ihren Mittelwerten fixiert sind. Die optimalen Werte der jeweiligen Komponenten wurden durch die Koordinaten des Mittelpunkts innerhalb der höchsten Konturebenen in jeder der Figuren dargestellt. Reaktionsoberflächenkurven können verwendet werden, um den Bereich optimaler Bedingungen innerhalb des experimentellen Bereichs zu bestimmen oder um zukünftige Experimente auf bessere Ergebnisse auszurichten. Wie in Abb. 3a gezeigt, zeigte die Temperatur in bestimmten Inkubationsperioden eine parabolische Reaktion, wobei die maximale Zellkonzentration bei einer Temperatur von 35 °C erreicht wurde. Extrem niedrige oder extrem hohe Temperaturen förderten die Zellvermehrung nicht. Die Variation der Inkubationszeit folgte ebenfalls einer parabolischen Kurve, wobei das optimale Zellwachstum zwischen 32 und 36 Stunden auftrat. Ebenso wurde das Reaktionsverhalten zwischen Temperatur und pH-Wert untersucht (Abb. 3b), wobei die Temperatur einen Einfluss auf die Zellkonzentration hatte, die einer parabolischen Kurve folgte und die optimale Temperatur bei 35 °C lag. Auch das andere Element, der pH-Wert, hatte einen Einfluss auf die Reaktion und die maximale Zellkonzentration lag im Bereich von 7 bis 7,5. In Abb. 3c lag die optimale Temperatur bei etwa 35 °C. Die Rührgeschwindigkeit beeinflusste die Zellkonzentration, die einer parabolischen Kurve folgte. Die Zellkonzentration war bei sehr niedrigen und sehr hohen Rührgeschwindigkeiten am niedrigsten, während die höchste Zählung zwischen 250 und 275 U/min erreicht wurde. Wie in Abb. 3d gezeigt, wurde die optimale Zellkonzentration erreicht, wenn die Inkubationszeit und der pH-Wert 32 bis 36 Stunden bzw. 7 bis 7,5 lagen. Abbildung 3e zeigt das Reaktionsmuster der Inkubationsperioden und der Bewegung, das sich als parabolisch herausstellte, wobei die optimale Zellkonzentration in den mittleren Werten lag. Bezüglich der Bewegung war das Reaktionsmuster parabolisch, wie in Abb. 3f dargestellt. Beim pH-Wert wurde die höchste Zellkonzentration etwa in der Mitte festgestellt, und eine Erhöhung des pH-Werts hatte keinen erkennbaren Einfluss auf die Zellkonzentration.

3D-Antwortoberfläche, die das Zusammenspiel aller bei der CCD-Optimierung berücksichtigten Komponenten darstellt. (a) Temperatur und Inkubationszeit. (b) Temperatur und pH-Wert. (c) Temperatur und Bewegung. (d) Inkubationszeit und pH-Wert. (e) Inkubationszeit und Rühren. (f) pH-Wert und Bewegung.

Die optimalen Werte der unabhängigen Variablen wurden mithilfe der Punktvorhersagefunktion der Design-Expert-Software vorhergesagt, wie in der Ergänzungstabelle T5 gezeigt. Die vorhergesagte maximale Zellkonzentration von 9,78 × 108 KBE/ml wurde bei optimalen Temperaturwerten von 35 °C, einer Inkubationszeit von 32 Stunden, einem pH-Wert von 7,5 und einer Rührgeschwindigkeit von 250 U/min vorhergesagt. Unter den vorhergesagten optimalen Parameterwerten betrug die maximale experimentelle Zellkonzentration 9,84 × 108 KBE/ml in Bioreaktoren im Labormaßstab (FUS-10 L). Der Pilotbioreaktor (V1: 300 L) wurde dann dreimal unter den optimierten Parametern betrieben, was zu einer durchschnittlichen Zellkonzentration von 2,05 × 109 KBE/ml führte. Schließlich wurde unter Verwendung dieser optimierten Parameter ein industrieller Bioreaktor (V2: 3000 l) dreimal betrieben, wobei eine durchschnittliche Zellkonzentration von 2,01 × 109 KBE/ml erzielt wurde, was eine starke Korrelation bei der Skalierung optimierter Parameter aus dem Labormaßstab zeigt in den industriellen Maßstab übertragen (Ergänzende Abbildung F4).

Abbildung 4a zeigt die vergleichende Konzentration lebensfähiger Zellen von formuliertem und Kontroll-CW-S (Kontrollkultur) bis zu einer Lagerdauer von 180 Tagen. Innerhalb von 30 Tagen nach der Lagerung wurde ein signifikanter Unterschied in der lebensfähigen Population zwischen formuliertem und Kontroll-CW-S beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Formulierung nach 180 Tagen Lagerung mehr als 3,8 × 108 (KBE/ml) unterstützte (Ergänzungstabelle T6). Bacillus subtilis CW-S starb langsam mit der Abnahme des pH-Werts in der geernteten Kontrollkultur ab (Abb. 4b).

Variation der Bacillus subtilis CW-S-Zellkonzentration und des pH-Werts in der Formulierung und Kontrolle über die Zeit. (a) Lebensfähigkeit der Zellkonzentration (KBE/ml). (b) Variabilität des pH-Werts.

Abbildung 5 zeigt die Auswirkungen von CW-S auf die aeroponische Miniknollenproduktion. Bei behandelten Pflanzen war der Transplantationsschock reduziert und die Überlebensrate war viel höher (77,7 ± 2,32 %) als bei Kontrollpflanzen (67,5 ± 3,48 %). Die Miniknollenmenge (15,6 Miniknollen/Pflanze), das Gewicht (9,29 g/Knolle) und die Wurzellänge (46,13 cm) waren bei den behandelten Pflanzen deutlich erhöht. Es wurde kein signifikanter Einfluss auf die Stolonenzahl beobachtet (Abb. 6). Während sieben Tagen der Nährstoffzufuhr und des Recyclings schwankte die Zellkonzentration zwischen 5,62 × 103 und 6,57 × 104 KBE/ml (Ergänzungstabelle T7). In einem ELISA-Test wurde weder in der Kontrolle noch in der behandelten Miniknolle ein Virus gefunden. Am Ende der aeroponischen Kultivierung wurden 14.516 Miniknollen von 1.313 überlebenden Pflänzchen in der Kontrollgruppe und 23.218 von 1.510 überlebenden Pflänzchen in der CW-S-Behandlung geerntet. Die Daten zeigen, dass die Gesamtzahl der Miniknollen in der CW-S-Behandlung aufgrund der höheren Überlebensrate der Pflänzchen und der erhöhten Anzahl von Miniknollen pro Pflänzchen deutlich höher war. Auch das höhere Gewicht der Miniknollen in den behandelten Pflänzchen kann die Anzahl der Miniknollen beeinflussen, indem die Häufigkeit der Ernte erhöht wird. Das CW-S kann als Pflanzenprobiotikum in einem Aeroponiksystem verwendet werden, um große Mengen hochwertiger Miniknollen zu produzieren.

Die Auswirkungen von CW-S auf die Miniknollenproduktion in der Aeroponik. (a) Überlebensrate der Pflänzchen nach der Transplantation in der Aeroponik. (b) Stolon-Nummer. c) Minituber-Nummer. (d) Minituber-Gewicht. (e) Wurzellänge. Balken ohne gemeinsame Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den behandelten Exemplaren hin.

Wurzel- und Ausläuferentwicklung innerhalb eines aeroponischen Systems. (a) Mit CW-S behandelte Kartoffelpflänzchen. (b) Kartoffelpflänzchen unter Kontrolle.

Experimente mit verschiedenen NPK-Dosen zeigten, dass CW-S den Ertrag und die ertragsbezogenen Kennzahlen bei Kartoffeln (Solanum tuberosum) steigerte (Abb. 7). Allerdings verbesserte sich der Ertrag pro Pflanze in T6 (Dosis1 + CW-S) und T7 (Dosis2 + CW-S) deutlich, der Ertrag pro Quadratmeter verbesserte sich jedoch nur in T6 (Dosis1 + CW-S) signifikant und die Überdachungsbedeckung vergrößerte sich in T7 (Dosis2 + CW-S). T5 (Dosis0 + CW-S) zeigte einen leichten Anstieg der relativen Dichte und keine nachteiligen Auswirkungen der anderen Behandlungen. In der Kartoffelproduktion hatte keine der CW-S-Behandlungen einen wesentlichen Einfluss auf die Sorten durchschnittliche Qualität, Klasse A oder Klasse B. Andererseits steigerten die CW-S-Behandlungen T6 und T7 den Ertrag bei Kartoffeln in Industriequalität deutlich (> 55). mm) Kartoffeln, während andere CW-S-Behandlungen geringfügige Verbesserungen zeigten (Abb. 8).

Die Zwei-Wege-ANOVA veranschaulicht die Wirkung von CW-S bei unterschiedlichen Düngerdosen. (a) Ertrag pro Pflanze. (b) Ertrag pro m2. (c) Überdachung. (d) Relative Dichte. (e) Prozentsatz minderwertiger Kartoffeln. (f) Kartoffelanteil der Klasse A. (g) Kartoffelanteil der Klasse B. (h) Prozentsatz der Kartoffeln in Überqualität (Industriequalität). (ns p ≥ 0,05, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001), Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 4). Balken ohne gemeinsame Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin.

Ein Vergleich von CW-S und Kontrolle hinsichtlich Ertrag und Kartoffelsorte. (a) Dosis0 und CW-S. (b) Dosis1 und CW-S. (c) Dosis2 und CW-S. (d) Dosis3 und CW-S. (e) Ein Vergleich verschiedener Noten.

Bei der Analyse der Merkmale für den industriellen Einsatz zeigt Tabelle 5, dass die spezifische Dichte und die Trockenmasse leicht erhöht waren, während der Gehalt an reduzierendem Zucker unverändert blieb und alle Behandlungen keinen Einfluss auf die anderen Parameter hatten. Auch bei Bratversuchen im Labor konnten keine nachteiligen Auswirkungen festgestellt werden. Dadurch können wir auf Landwirtebene CW-S mit Dosis 1 oder Dosis 2 kombinieren, um den Einsatz von chemischem Dünger zu reduzieren und gleichzeitig die Produktivität von Kartoffeln in Industriequalität (> 55 mm) für die Herstellung von Pommes Frites, Chips und anderen Produkten zu steigern.

Um ein wirksames kommerzielles probiotisches Pflanzenprodukt zu entwickeln, müssen mehrere Herausforderungen bewältigt werden, darunter Isolierung, Screening, Produktion, Formulierung und Feldbewertung. Bei der Herstellung von Wirkstoffen müssen kostengünstige Rohstoffe verwendet werden, um sowohl kostengünstig als auch qualitativ hochwertig zu sein und eine gute Feldleistung zu zeigen27.

Während des Isolierungs- und Screening-Prozesses sollte der Wirkstoff mehrere pflanzenwachstumsfördernde Eigenschaften aufweisen. In dieser Forschung wurde Bacillus subtilis CW-S aus einem Weizenfeld isoliert, was darauf hindeutet, dass es sich um einen für Pflanzen nützlichen Mikroorganismus handeln könnte28. Probiotische Pflanzentests ergaben, dass der Stamm CW-S in der Lage war, IAA zu produzieren, Phosphat zu lösen, Stickstoff zu binden und Antagonismus gegen Phytopathogene wie Curvularia spicifera, Alternaria alternative, Sclerotium theobromae und Fusarium equiseti zu zeigen. In einem In-vitro-Sämlingstest förderte dieser Stamm das Pflanzenwachstum, indem er die vegetativen Wachstumsparameter von Weizensämlingen deutlich steigerte. Die pflanzliche probiotische Aktivität dieses Stammes war vergleichbar mit der in früheren Studien beschriebenen, die zeigten, dass Bacillus subtilis ein rhizosphärisches Bakterium mit zahlreichen positiven Auswirkungen auf Nutzpflanzen und Pflanzen ist2,29,30.

Da Mikroben über ein breites Spektrum an physiologischen Eigenschaften verfügen, wird ihr Wachstum stark von den Medienbestandteilen beeinflusst, insbesondere von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen31. Melasse wurde als günstiges Substrat ausgewählt, da sie zum Wachstum mehrerer Mikroben verwendet wurde, darunter B. subtilis32,33,34. Aufgrund seines hohen Zuckergehalts, seiner kolloidalen Suspension, seiner Vitamine und Stickstoffverbindungen wird Melasse häufig bei der Produktion von Mikroorganismen26 verwendet. Harnstoff wurde als Stickstoffquelle ausgewählt, da er von mehreren Autoren bei der Kultivierung von Mikroorganismen verwendet wurde35,36. In unseren Medienbewertungsexperimenten erwiesen sich Melasse und Harnstoff als geeignete Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquellen. Wir konnten die Zellkonzentration (2,01 × 109 KBE/ml) durch die Verwendung einfacher Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verbessern, und die hier gezeigten Ergebnisse sind mit denen vergleichbar, die zuvor von Yánez-Mendizábal et al. berichtet wurden. (2012; 3 × 109 KBE/ml) und Khardziani et al. (2017; 2,3 × 109 KBE/ml)34,37.

Zusätzliche Parameter wie pH-Wert, Temperatur, Bewegung und Belüftung spielen in Kombination mit Kohlenstoff- und Stickstoffeinträgen eine wichtige Rolle beim Wachstum von B. subtilis34,38. Die Response-Surface-Methodik ist ein leistungsfähiges statistisches Werkzeug zur Analyse und Bewertung der Wechselwirkungen verschiedener Prozessfaktoren39. In der aktuellen Studie führte die statistische Prozessoptimierung mithilfe von PBD und CCD zu einer deutlich höheren Zellkonzentration (2,01 × 109 KBE/ml), die mit früheren Untersuchungen vergleichbar war39,40,41,42. Für eine kommerzielle Anwendung zu geringeren Kosten ist die Herstellung von CW-S in großem Maßstab erforderlich. Mehrere Studien untersuchten den Produktionsprozess in verschiedenen Volumina von 1 bis 70 l, um große Mengen an Biomasse und Sekundärmetaboliten zu erhalten39,42,43,44. In dieser Studie wurde der CW-S-Herstellungsprozess im Labormaßstab (10 l), im Pilotmaßstab (300 l) und im industriellen Maßstab (3000 l) evaluiert. Die Bewertungsergebnisse zeigten, dass der optimierte Prozess im industriellen Maßstab (2,01 × 109 KBE/ml) gut funktionierte und höhere Zellkonzentrationen als in Laborbioreaktoren (9,84 × 108 KBE/ml) aufwies. Dies wird der erste Bericht über die Bewertung des Produktionsprozesses von Bacillus subtilis im industriellen Maßstab von 3000 Litern sein. Dies könnte den Weg für die kommerzielle Produktion von Bacillus subtilis in großem Maßstab zu geringeren Kosten ebnen.

Bei der Entwicklung mikrobieller Produkte sind Haltbarkeit und Lebensfähigkeit der Mikroben entscheidende Überlegungen. In unseren Experimenten erhöhten Polymermaterialien wie Polyvinylpyrrolidon (PVP), Carboxymethylcellulose (CMC) und das Tensid Polysorbat 20, die der Formulierung zugesetzt wurden, die Lebensfähigkeit der Zellen. Die Formulierung unterstützte mehr als 180 Tage lang > 3,8 × 108 KBE/ml CW-S. PVP, ein ungiftiges Polymer, könnte eine günstige Umgebung für das Überleben von Bakterien bieten, und CMC fungiert als Adjuvans66.

Mehreren Berichten zufolge werden Aeroponiksysteme zu einer beliebten Technologie für die Herstellung hochwertiger Miniknollen45,46. In dieser Studie wurden Miniknollen in einem Aeroponiksystem hergestellt, bei dem CW-S mit dem Nährstoffspray und dem Blattspray ausgebracht wurde. Die Anzahl, das Gewicht und die Wurzellänge der Miniknollen nahmen bei den behandelten Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollen deutlich zu. Die Anzahl der von den behandelten Pflanzen produzierten Knollen betrug 15,6 pro Pflanze, was angemessen war und innerhalb des von Farran et al. angegebenen Bereichs lag. (2006) von 13,4 pro Pflanze47. Unsere Ergebnisse hinsichtlich der Knollenzahl und des durchschnittlichen Knollengewichts waren nicht mit denen anderer vergleichbar, da wir eine andere Sorte verwendeten48. Die Mehrheit der zitierten Forscher erwähnten weder Wurzellänge, Stolonenzahl noch die Überlebensraten transplantierter Pflänzchen, und es gab keine Hinweise auf die Verwendung pflanzlicher Probiotika in der Aeroponik wie Bacillus subtilis46,47,48,49. Bacillus subtilis CW-S schnitt in der Aeroponik gut ab, da es Pflanzen durch induzierte systemische Resistenz (ISR), Biofilmwachstum und Lipopeptidproduktion eine Toleranz gegenüber biotischem und abiotischem Stress bot30,50.

Unter Feldbedingungen verbesserte CW-S den Kartoffelertrag und die ertragsbezogenen Parameter (Ertrag pro Pflanze, Ertrag pro m2, Überdachung und Industriekartoffeln) und verbrauchte gleichzeitig weniger Dünger als die Kontrolle (unbehandelt). Der Großteil der Bacillus subtilis-Experimente konzentrierte sich auf die biologische Kontrolle von Krankheiten49,51. Bacillus subtilis wurde nicht im Hinblick auf die Produktion verschiedener in der Industrie verwendeter Kartoffelsorten bewertet. Laut dieser Studie konnte CW-S den Kartoffelertrag in Industriequalität steigern, ohne seine industriellen Eigenschaften zu verändern.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Herstellung eine wichtige Phase in der Entwicklung eines pflanzlichen probiotischen Produkts ist, wobei kostengünstiges mittleres Design, Optimierung und Skalierung des Produktionsprozesses alle zur Gestaltung einer Produktion im großen Maßstab beitragen. Die Wirksamkeit des Produkts in neuartigen Anwendungen wie der aeroponischen Miniknollen- und Industriekartoffelproduktion ist ein guter Hinweis auf seine Wirtschaftlichkeit. Aus dieser Perspektive liefert die aktuelle Studie Belege dafür, dass die industrielle Produktion von B. subtilis CW-S ein kompetentes pflanzliches probiotisches Produkt liefert.

Das pflanzliche Probiotikum B. subtilis, Stamm CW-S, wurde aus dem rhizosphärischen Boden eines Weizenfeldes in Nilphamari, Bangladesch (26°15′56,1"N 88°54′22,4"E) isoliert. Eine verdünnte rhizosphärische Bodenprobe wurde mit Hitze (80 °C für 10 Minuten) und 1 % NaAz (Natriumazid) behandelt. Wärmebehandelte Bodensuspensionen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde es seriell verdünnt, bevor es auf LB-Agar ausgebreitet wurde, um eine Einzelkolonie-Isolierung gemäß der Methode von Tran et al. zu isolieren. (2021) Verbreitungsmethode. Einzelne Kolonien wurden nach 26-stündiger Inkubation bei 28 ± 2 °C4 gewonnen. Um die Fähigkeit zur Sporenproduktion sicherzustellen, wurden einzelne Kolonien auf Sporulationsmedien ausplattiert. Bacillus sp. produziert ovale Endosporen, die in stressigen Umgebungen über längere Zeiträume ruhen können. Es wurde eine mikroskopische Untersuchung von Endosporen und Sporen sowie stäbchenförmigen Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop (Axio Imager A1, Carl Zeiss, Deutschland) bei 640X durchgeführt. Die Isolate wurden gramgefärbt und die grampositiven Isolate wurden für den MR-VP-Test ausgewählt. Anschließend wurden die Isolate auf Stärkehydrolyse, Katalase und Citrataktivität sowie auf Wachstum in 7,0 % NaCl-haltigen NA-Medien bei 45–50 °C getestet. Diejenigen, die in diesem Medium positive Ergebnisse zeigten, wurden ausgewählt. Durch Ausstreichen der Isolate auf Bacillus-Differenzierungsagarmedien, die Bromkresolpurpur enthielten, wurden sie zusätzlich auf ihre Mannitol-Fermentationsfähigkeit untersucht. In diesem Medium wurde Bromkresolpurpur als pH-Indikator zum Nachweis der Mannitol-Fermentation verwendet. Um Reinkulturen zu erhalten, wurden einzelne Kolonien gepflückt und erneut auf Bacillus-Differenzierungsagarmedien (HI-Media Laboratories Private Limited, LBS Marg, Mumbai, Indien) ausgestrichen. Bevor die Sequenzierungstechnologie zur Identifizierung von Bakterien eingesetzt wurde, waren diese biochemischen Tests für die primäre Identifizierung erforderlich4,52. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Eine einzelne Kolonie von CW-S wurde verwendet, um genomische DNA mit dem PrepManUltra®-Reagenz (Applied Biosystems) zu extrahieren, und die DNA-Konzentration wurde mit einem Spektrophotometer gemessen. Eine Arbeitslösung von 1 ng/μl wurde durch Verdünnen einer DNA-Stammlösung hergestellt. Auf dem Peltier-Thermocycler der MyGeneTM-Serie (LongGene Scientific Instruments Co., Ltd., Hangzhou, China) wurden die drei Fragmente des ribosomalen 16S-RNA-Gens mit dem MicroSeq® Full Gene 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit amplifiziert. Vor der Sequenzierung wurden die amplifizierten Produkte mit ExoSAP-IT®-Reagenz (USB) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Zyklussequenzierung für jedes amplifizierte Produkt wurde mit dem MicroSeq® Full Gene 16S rDNA Bacterial Identification Sequencing Kit durchgeführt. Die Zyklussequenzierungsprodukte wurden mittels Ethanolfällung gereinigt, bevor sie an das National Institute of Biotechnology (NIB) in Savar, Dhaka, geliefert wurden, wo sie in HiDi-Formamid (Applied Biosystems) gelöst und auf einem 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) untersucht wurden. Der Ablauf wurde im NIB-Bericht ausführlich dokumentiert. Die Evolutionsgeschichte wurde mithilfe des Maximum-Likelihood-Ansatzes und des Tamura-Nei-Modells53 geschätzt. Es wurde der Baum mit der größten Log-Wahrscheinlichkeit angezeigt (−13.678,84). Der/die anfänglichen Bäume für die heuristische Suche wurden automatisch mithilfe der Neighbor-Join- und BioNJ-Algorithmen auf einer Matrix paarweiser Abstände erstellt, die mithilfe des Tamura-Nei-Modells geschätzt wurden, und dann die Topologie mit dem höchsten Log-Likelihood-Wert ausgewählt. Bei dieser Untersuchung wurden zehn Nukleotidsequenzen verwendet, wobei die ersten + zweiten + dritten + nichtkodierenden Codonpositionen enthalten waren. Insgesamt wurden im endgültigen Datensatz 1456 Positionen gefunden. MEGA X wurde zur Durchführung einer Evolutionsanalyse54 verwendet.

Qualitative Messung der Fähigkeit zur Stickstofffixierung (In-Vitro)

Um die Fähigkeit zur Stickstofffixierung zu testen, wurde die Kultur über eine halbfeste Platte mit stickstofffreiem Malatmedium (Nfb) ausgestrichen und 72 Stunden lang bei 30 ± 2 °C inkubiert. Durch die Nutzung von freiem Stickstoff könnten in diesem Medium Bakterien mit der Fähigkeit zur Stickstofffixierung wachsen.

Quantitative Schätzung der Phosphatlösung (verfügbares P)

Die Vanadomolybdophosphorgelb-Farbmethode im Salpetersäuresystem wurde für die quantitative Schätzung von solubilisiertem P durch CW-S56 leicht modifiziert. In einem 100-ml-Messkolben wurden 0,02195 g Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) in 40 ml destilliertem Wasser gelöst. Dann wurden 2,5 ml 7 N H2SO4 zugegeben, gemischt und mit destilliertem entionisiertem Wasser auf die gewünschte Konzentration verdünnt, was 50 ppm P ergab. Dies entsprach einer Konzentration von 50 mg/L (0,05 mg/ml). In jedes Reagenzglas wurden 2 ml einer Mischung der Lösungen A (25 g/L Ammoniummolybdat [(NH4)6Mo7O24.4H2O]) und B (1,25 g/L Ammoniummetavanadat [NH4VO3] und 250 ml HNO3) gegeben zu einer Phosphat-Stammlösung mit den folgenden Konzentrationen: (0,00, 6,25, 12,5, 25,0 und 50,0 ppm). Nach 10 Minuten wurde die Intensität der gebildeten gelben Farbe spektrophotometrisch bei 490 nm gemessen (BK-D590 Double Beam Scanning UV/VIS-Spektrophotometer). Die Standardkurve wurde durch Auftragen der Absorption bei 490 nm gegen die P-Konzentration erstellt. Einzelne CW-S-Kolonien wurden zur Beimpfung von LB-Brühe in Erlenmeyerkolben verwendet, die dann 48 Stunden lang bei 30 °C und 180 U/min inkubiert wurden. Für den nächsten Schritt wurde Pikovskayas Medium (PKV-Bouillon) sowie eine Kontrolle (Probenblindprobe) vorbereitet, die nicht mit Bakterienkultur beimpft war. Mithilfe der Streuplattentechnik wurden die in LB-Medien produzierten CFU von CW-S gezählt. In 250-ml-Erlenmeyerkolben wurde eine äquivalente Menge an Zellen (108 KBE) in 50 ml PKV-Brühe inokuliert. Danach wurden die Kolben 48 Stunden lang bei 30 °C und 180 U/min inkubiert. Gleichzeitig wurde PKV als Mediumkontrolle unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Nach 72 Stunden wurde 1 ml Bakterienkulturen aus jeder beimpften und Kontroll-PKV-Brühe 10 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände der Kontrollkulturen und der inokulierten PKV-Kulturen zehnmal mit 200 µL Überstand und 1800 µL destilliertem Wasser verdünnt. Danach wurden 2 ml Endreagenz (Lösung A + Lösung B) hinzugefügt und bei Raumtemperatur mindestens 20 Minuten lang inkubiert. Schließlich wurde mithilfe eines Spektrophotometers zur Messung der optischen Dichte (OD) bei 490 nm die Menge an gelöstem P anhand der Standardkurve geschätzt.

Quantitative Schätzung der Produktion von Indol-3-Essigsäure (IAA).

Mit geringfügigen Modifikationen wurde Indol-3-Essigsäure mithilfe von Bric et al. bestimmt. (1991)57.Um die IAA-Produktion zu bestimmen, wurden Isolate in Nährbrühe beimpft und 48 Stunden lang bei 29 ± 2 °C inkubiert. 1 ml der beimpften Kultur wurde in 10 ml frische Brühe mit 2 mg/ml L-Tryptophan gegeben und 72 Stunden lang bei 29 ± 2 °C inkubiert. Ungefähr 2 ml Kulturlösung wurden 1 Minute lang bei 15.000 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde zum Nachweis der IAA-Konzentration verwendet. Ein ml des Überstands wurde mit 2 ml Salkowski-Reagenz nach Gordon und Weber (1951)58 gemischt. Nach 25–30 Minuten wurde die Absorption jeder Lösung mit einem Spektrophotometer bei 530 nm (BK-D590 Double Beam Scanning UV/VIS Spectrophotometer) gemessen. Herstellung einer Reihe reiner IAA-Lösungen (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 und 65 g/ml reines IAA in jeder Lösung) und Messung der Absorption Die Messung dieser Lösungen in einem Spektrophotometer bei 530 nm ergab eine IAA-Standardkurve. Die von CW-S produzierte IAA-Konzentration wurde durch Auftragen in dieses Standarddiagramm bestimmt. Als Kontrolle wurden Überstände von nicht beimpften Reagenzgläsern verwendet, und es wurde keine erkennbare Farbe festgestellt.

CW-S wurde gegen Phytopathogene wie Curvularia spicifera (NCBI-Zugangsnummer: MK478831), Lasiodiplodia theobromae (MK478824), Sclerotium delphinii (MK478832), Fusarium equiseti (MK478826) und Alternaria alternata (MK478825) getestet (erhältlich bei Apex Biotechnology Laboratory Culture). Sammlung) unter Verwendung eines dualen Kulturansatzes59. Ein Pfropfen mit einem Durchmesser von 5 mm, der Myzel von fünf Tage alten gezielten phytopathogenen Pilzen enthielt, wurde in die Mitte der PDA-Platten gelegt. Einzelne CW-S-Bakterienkolonien wurden etwa 3 cm vom Pilz entfernt platziert. Die Platte wurde nach der Inokulation sieben Tage lang im Dunkeln bei 30 ± 2 °C inkubiert. Im Experiment wurden mindestens zehn Replikationen verwendet. Die antagonistische Aktivität von CW-S wurde als Hemmungsprozentsatz (I) ausgedrückt. Es wurde mit Gl. berechnet. (3).

Dabei stellt D0 den Wachstumsdurchmesser (cm) des Pilzes auf der Kontrollseite dar und Db bezeichnet den Durchmesser (cm) des Pilzes bei Belastung mit CW-S (ergänzende Abbildung F5).

Nach dem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser (1–2 Mal) wurden die Weizensamen durch Eintauchen in 3 % Natriumhypochlorit (5 Minuten) und anschließendes Eintauchen in 95 % Ethanol (20 Sekunden; vom Eintauchen bis zum Waschen mit destilliertem Wasser) oberflächensterilisiert. und schließlich siebenmal mit sterilem destilliertem Wasser waschen. Der Boden wurde nach einstündiger Autoklavierung bei 121 °C und 15 psi desinfiziert. Der autoklavierte Boden wurde 48 Stunden lang bei einer konstanten Temperatur (70 ± 2 °C) im Ofen getrocknet, bevor er in Versuchstöpfe gefüllt wurde. In jedem Behälter befanden sich 200 g getrocknete Erde. In jeden Topf wurden drei Pflanzen gesät. Es gab zwei Behandlungen: T1 für behandelte Sämlinge (CW-S) und T0 für nicht inokulierte Sämlinge (Kontrolle). Für jede Behandlung wurden in diesem Experiment 20 randomisierte Replikationstöpfe verwendet. Alle Pflanzen wurden in einer Pflanzenwachstumskammer (BIOBASE: BJPXA450) bei 25 °C und 68 ± 2 % relativer Luftfeuchtigkeit gezüchtet. Zusätzliche Pflanzen wurden 6 DAS (Tage nach der Aussaat) aus den Töpfen entfernt, wobei eine Pflanze in jedem Topf belassen wurde. Nach der Aussaat der Samen im Topf wurden 2 ml CW-S zur Beimpfung durch eine Mikropipette zugeführt. Die Pflanzenentwicklung wurde durch die Anwendung von 2 ml halbstarker Hoagland-Düngerlösung ohne Phosphor (P) in jedem Topf in dreitägigen Abständen unterstützt60. Nach 35 DAS wurden aus jeder Behandlung zehn konkurrierende Sämlinge zur Datenerfassung geerntet.

Für die submerse Kultur im Labormaßstab wurde LB-Medium (Luria Bertani-Brühe) verwendet, für die Produktion im großen Maßstab war jedoch ein neuartiges Medium erforderlich. Das Ziel bestand darin, ein kostengünstiges Medium zu entwickeln, das höhere Zellkonzentrationen liefern, die Zellkonzentration und den pH-Wert während der gesamten Lagerung aufrechterhalten und in Pflanzentests mit lokal verfügbaren Materialien wie Melasse (Rajshahi Sugar Mill Ltd., Harian, Rajshahi, Bangladesch) gute Ergebnisse erzielen kann ) und Harnstoff (Karnafuli Fertilizer Company, Chittagong, Bangladesch). Die Produktion von Biodünger erfordert eine hohe biologische Leistung (KBE/Einheit). Als Kontrolle wurde das LB-Bouillon-Medium verwendet, das teure Stickstoffquellen enthält. Ziel der Studie war es, herauszufinden, wie sich verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen auf die CFU-Produktion auswirken, und kostengünstige Kohlenstoff- und Stickstoffquellen auszuwählen. CW-S (Bacillus subtilis) wurde zunächst auf 10 verschiedenen, speziell entwickelten Produktionsmedien kultiviert [BS1: Saccharose (10 g/L), (NH4)2HPO4 (1 g/L); BS2: Dextrose (10 g/L), (NH4)2HPO4 (1 g/L); BS3: Glycerin (10 g/L), (NH4)2HPO4 (1 g/L); BS4: Stärke (10 g/L), (NH4)2HPO4 (1 g/L); BS5: Melasse (20 g/L), (NH4)2HPO4 (1 g/L); BS6: Saccharose (10 g/L), CO(NH2)2 (2 g/L); BS7: Dextrose (10 g/L), CO(NH2)2 (2 g/L); BS8: Glycerin (10 g/L), CO(NH2)2 (2 g/L); BS9: Stärke (10 g/L), CO(NH2)2 (2 g/L); BS10: Melasse (20 g/L), (CO(NH2)2 (2 g/L)], parallel zum LB-Medium, um zu verstehen, wie sie den biologischen Ertrag beeinflussten. Die Medien BS1 bis BS10 wurden mit MgSO4.7H2O (0,03) ergänzt g/L); entfettetes Sojabohnenmehl (1,25 g/L); Sojaöl (2 ml/L) als Antischaummittel und die Anteile der Pufferkomponenten [K2HPO4 (0,025 g/L); KH2PO4 (0,025 g/L) ]. Die Medienbewertung wurde in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml jedes Mediums mit drei Wiederholungen durchgeführt. Die Kolben wurden mit 1 ml frisch zubereitetem Inokulum beimpft und unter ständigem Schütteln bei 180 U/min bei 30 ± 2 °C gehalten Alle Flaschen wurden nach 36 Stunden entfernt und auf Tests der koloniebildenden Einheit (CFU) analysiert.

Der Gesamtkohlenhydratgehalt wurde mit der kolorimetrischen Anthrone-Methode61 bestimmt. Melasseproben wurden mit 2 % Anthronlösung in 98 % H2SO4 behandelt. Anschließend wurden die Proben 10 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erhitzt. Die Absorption der Proben wurde spektrophotometrisch bei 578 nm unter Verwendung des UV-3300PC von Tomos Biotools (Shanghai) Co., Ltd. gemessen, nachdem sie auf Raumtemperatur abgekühlt wurden. Die Kohlenhydratmenge (mg/ml) wurde anhand der Standardkalibrierungskurve für Glukose berechnet. Der Kohlenhydratgehalt wurde in Prozent (m/m) gemessen.

Einzelne Kolonien wurden aus einer mit Glycerin konservierten Kultur nach 20-stündiger Inkubation bei 35 °C gewonnen. Die anfängliche Brühenkultur wurde aus einzelnen Kolonien in einem 250-ml-Kolben mit 50 ml Medium nach 20-stündiger Inkubation bei 35 °C und 200 U/min hergestellt. Danach wurde die Kulturbrühe unter den gleichen Bedingungen subkultiviert. Schließlich wurde aus dieser Subkultur nach 20-stündiger Inkubation bei 35 °C und 200 U/min in einem 1000-ml-Kolben mit 300 ml LB-Medium eine Impfkultur gewonnen.

Ein PBD ist ein Filterdesign, das kritische Faktoren aus einer Vielzahl von Faktoren effektiv identifiziert, die letztendlich die Ergebnisse beeinflussen. Mit insgesamt 12 experimentellen Versuchen, die von der Software erstellt wurden, wurde die PBD verwendet, um wichtige Faktoren zu identifizieren, die die Zellkonzentration von Bacillus subtilis (CW-S-Stamm) beeinflussen (Tabelle 2). Ein quadratisches Modell erster Ordnung wurde verwendet, um eine große Anzahl unabhängiger Faktoren zu filtern und eine kleinere Anzahl für die weitere Optimierung auszuwählen, sodass wir n-1 Faktoren mit nur n Experimenten untersuchen konnten. Die Differenz zwischen dem durchschnittlichen Antwortwert, der bei einer hohen (+1) und einer niedrigen (–1) Einstellung gemessen wurde, wurde zur Berechnung des Haupteffekts für jeden Faktor verwendet. Zur weiteren Optimierung wurde das CCD-Statistikmodell verwendet, um die Faktoren zu berücksichtigen, die einen signifikanten Einfluss auf die Zellkonzentration hatten. Rührgeschwindigkeit (A), Belüftung (B), Inokulumgröße (C), Prozentsatz der Kohlenstoffquelle (Melasse; D), Prozentsatz der Stickstoffquelle (Harnstoff; E), Inkubationszeit (F), pH-Wert (G) und Temperatur ( H) wurden alle berücksichtigt, wobei ihre oberen und unteren Bereiche in Tabelle 6 aufgeführt sind. Die oberen und unteren Grenzen des Bereichs jeder Variablen wurden durch diese Ebenen definiert. Gleichung (4) zeigt die PBD basierend auf einem Polynommodell erster Ordnung für die mathematische Modellierung, das verwendet wurde:

Dabei steht „y“ für die vorhergesagte Reaktion, x1–x11 für die Parameter (Faktoren), a1–a11 für die relevanten Koeffizienten und a0 für den Achsenabschnitt des Mittelwerts. Von den signifikanten unabhängigen Variablen mit einem Wahrscheinlichkeitswert (p-Wert < 0,05), d. h. größer als 95 % des Konfidenzniveaus aller Intervalle, wird angenommen, dass sie einen wesentlichen Einfluss auf das Wachstum haben62,63.

Die signifikanten Variablen des PBD wurden in den CCD Software Design Expert eingespeist, ein beliebtes quadratisches Testdesign für die sequentielle Testentwicklung, das eine Regressionsanalyse verwendet, um Komponentenniveaus für eine optimale Reaktion vorherzusagen. Temperatur, pH-Wert, Inkubationszeit und Bewegung wurden auf fünf verschiedenen Niveaus (–2, –1, 0, 1, 2) untersucht, um zu sehen, wie sie sich auf die Zellkonzentration des Stamms CW-S auswirken (Tabelle 7). Insgesamt 30 Experimente wurden unter Verwendung eines vollfaktoriellen zentralen Verbunddesigns mit 16 (24) Würfelpunkten, 6 Mittelpunkten und 8 (4 × 2) Sternpunkten erstellt. Die Beziehung zwischen Zellkonzentration und unabhängigen Faktoren wurde mithilfe eines quadratischen Modells charakterisiert, das auf dem Polynom zweiter Ordnung Gl. (5)64.

Dabei ist Y die gemessene Reaktion (Zellkonzentration), X1 und X2 signifikante unabhängige Variablen, β12 der interaktive Regressionskoeffizient und β0 ein konstanter Term sowie β1 und β2 die linearen Regressionskoeffizienten. Zur Bestimmung der Signifikanz und des Regressionskoeffizienten des Modells wurde eine ANOVA verwendet. Der Koeffizient (R2) wurde berechnet, um die Anpassung des Modells zu messen, und der Fisher-F-Test wurde durchgeführt, um die statistische Signifikanz zu demonstrieren. Die gegenseitigen Korrekturen zwischen den relevanten Parametern wurden anhand der Antwortoberflächen- und Konturstrukturen der vom Modell erwarteten Antworten65 bewertet.

Um das RSM-generierte mathematische Modell zu validieren, wurde ein Drei-Replikationsexperiment unter Verwendung der erwarteten optimalen Parameterbedingungen durchgeführt. Die optimierten Parameter wurden im Rahmen des Scale-Ups für den Betrieb des Pilot- und Industriebioreaktors verwendet.

Nach Abschluss der Kulturstunde wurde die Kultur mit 2 ± 0,1 % Polyvinylpyrrolidon (PVP), 0,1 ± 0,02 % Carboxymethylcellulose (CMC) und 0,025 ± 0,005 ml/L Polysorbat 20 ergänzt. Anschließend wurde die Kultur in HDPE-Flaschen gegeben Nach zweistündigem Mischen wurde die Stabilität der Formulierung einer Qualitätskontrolle unterzogen. Mit dem gleichen Verfahren wurde auch eine Kontrollkultur ohne Zugabe der Zusätze hergestellt. In monatlichen Abständen von bis zu 180 Tagen wurde das Überleben von Bacillus subtilis CW-S in einer flüssigen Formulierung, die bei 25 ± 2 °C in einem biochemischen Inkubator unter dunklen Bedingungen gelagert wurde, mithilfe von Plattenzählverfahren untersucht66.

Das Experiment zur Miniknollenkultivierung wurde im Netzhaus-Aeroponiksystem bei ABBL (Apex Bio-fertilizer & Bio-pesticides Ltd., Gobindaganj, Gaibandha, Bangladesch: 25°148ʹN, 89°89ʹ) durchgeführt (Ergänzende Abbildung F6). Die Gewebekulturpflänzchen wurden aus der Sorte SANTANA (Nederlands Potato Consultative Foundation: GBR165) hergestellt. Das Experiment war in zwei Blöcke unterteilt, einen zur Kontrolle und einen zur Behandlung, wobei jeder Block über eine eigene Nährstoffquelle verfügte. Jeder Block mit drei Gestellen hat eine Gesamtkapazität von 1944 (3 × 648) Pflänzchen. Die Pflänzchen wurden in einer Pflückschale mit Kokostorf gemischt mit CW-S-Kultur bei 25 ± 2 °C gehärtet. Nach 15 Tagen Aushärtung wurden die Pflänzchen in die Aeroponik-Gestelle verpflanzt. Dann wurde die Überlebensrate aufgezeichnet. Jeden siebten Tag wurden die Nährlösungen durch eine neue Lösung mit CW-S (5 %) ersetzt. Am ersten und siebten Tag wurde die Konzentration der CW-S-Zellen in der Nährlösung gemessen. Alle 15 Tage wurde CW-S auf die Blätter gesprüht. Nach 25 Tagen Transplantation wurden die Miniknollen im Abstand von sieben Tagen geerntet. Alle Miniknollen wurden nach 80 Tagen geerntet und die Daten aufgezeichnet (Ergänzende Abbildung F7). Die Miniknolle sowohl der Kontroll- als auch der Behandlungsgruppe wurde dann im BARI (Bangladesh Agricultural Research Institute, Joydebpur, Dhaka, Bangladesch) auf Virusnachweis getestet.

Nährstofflösungen und Anbaubedingungen

In diesem Experiment wurde eine optimierte Nährlösung verwendet (gL−100: CaNO3 25, KNO3 50, KH2PO4 15, MgSO4 20, Fe EDTA 0,30 und Fetrilon combi 1,5). In der ersten Woche nach der Pflänzchentransplantation wurde die halbe Stärke verwendet, danach jedoch die volle Stärke. Der pH-Wert und der EC-Wert der Nährlösung betrugen 6,25–6,80 bzw. 1,5–2,0 ms/cm. Die Temperaturen schwankten nachts zwischen 7 und 11 °C und tagsüber zwischen 15 und 25 °C.

Das Feldexperiment wurde im ABBL-Forschungsfeld durchgeführt, um die Wirkung des formulierten CW-S auf den Ertrag und ertragsbezogene Parameter von Kartoffeln (Sorte: SANTANA) zu bewerten. Jedes Experiment wurde in einem Split-Plot-Design mit vier Wiederholungen durchgeführt. Jedes Grundstück war 6 m × 3,5 m groß. Die Studie umfasste die Behandlungen T1-T4 (keine CW-S-Anwendung) und T5-T8 (CW-S-Anwendung) sowie vier NPK-Dosen: kein NPK (Dosis0), 50 % NPK (Dosis1; 130, 125 und 187,5). kg/h), 100 % NK (Dosis2; 260, 375 kg/h), mit 50 % P (Dosis2; 125 kg/h) und 100 % NPK (Dosis3; 260, 250 und 375 kg/h). Während der letzten Landvorbereitung wurden Gips, Zinksulfat und Bor als Grundanwendung in Mengen von jeweils 8, 10 und 10 kg/ha ausgebracht. Mitte November erfolgte die Aussaat (Ergänzungsabbildung F8) auf dem Feld. Jede Parzelle hatte einen Saatgut-Linienabstand von 60 cm und einen Pflanzen-zu-Pflanzen-Abstand von 25 cm. Mit Ausnahme von Harnstoff wurden alle Düngemittel als Grunddosis bei der abschließenden Bodenvorbereitung ausgebracht. In drei Zeitabständen wurden unterschiedliche Stickstoffdosierungen (Harnstoff) appliziert. Bei der Ernte wurden ertragsbestimmende Parameter und der Ertrag erfasst, um die reduzierte Düngerdosis für CW-S zu ermitteln. Laut Karim et al. (2010) wurden Kartoffeln basierend auf dem Durchmesser der Kartoffel in der Mitte in vier Klassen eingeteilt, darunter unterklassige (weniger als 28 mm), Klasse A (28–40 mm), Klasse B (41–55 mm), und überhöht (Industriequalität ˃ 55 mm)67. Das spezifische Gewicht wurde gemäß Schippers (1976)68 gemessen. Proben aus jeder Behandlung (T1–T8) wurden gemäß Hassanpanah et al. ausgewertet. (2011) und Abong et al. (2010) untersuchten die Auswirkungen von CW-S auf die industriellen Merkmale von Kartoffeln69,70.

Es wurden Proben entnommen und unter dem Mikroskop auf Wachstum und Kontamination untersucht. Anschließend wurden die Proben auf NA-Platten (HIMEDIA) ausgestrichen, um die Reinheit zu bestätigen. Anschließend wurden die Platten 24–48 Stunden bei 35 °C inkubiert. Wenn andere Kolonien als der typische Bacillus-Typ nachgewiesen wurden, wurde die Probe als kontaminiert angesehen. Anschließend wurden die Zellsuspensionen mit Verdünnungsfaktoren im Bereich von 10–1 bis 10–7 verdünnt. Anschließend wurden die verdünnten Zellsuspensionen auf DM-Agarplatten verteilt und bei 35 °C inkubiert. Nach 48-stündiger Inkubation wurde die Zellkonzentration berechnet. Zur Bestimmung der Zellkonzentration von B. subtilis71 wurde die Ausbreitungsplattentechnik verwendet.

In dieser Untersuchung wurden drei verschiedene Arten von Bioreaktoren verwendet, die vom Labor- bis zum Industriemaßstab reichen. Für die PBD- und RSM-Experimente wurden drei Laborbioreaktoren (FUS-10 L) verwendet. Der optimierte Parameter wurde im industriellen Maßstab mit einem Pilot- (V1: 300 L) und einem industriellen Bioreaktor (V2: 3000 L) von Wenzhou Daysly Technology Co. Ltd., Zhejiang, China, getestet. Das Experiment wurde in der Fermentationsanlage von ABBL (ergänzende Abbildung F9) durchgeführt, die über sämtliche Versorgungseinrichtungen verfügt, nämlich einen ölfreien Kompressor (Atlas Copco, Modell: ZT37, 8,6–50 Hz, Kapazität: 5,5 m3). /min), ein Industriekühler (KL-LSF30S, Kapazität: 25 T), ein ölbetriebener Kessel (ST 1300EF) usw. Zur Automatisierung des Prozesses wurde ein computergestütztes Daten-Bioverarbeitungssystem-Programm (MCGS) verwendet. Integrierte Biosensoren wurden zur Steuerung von Temperatur, pH-Wert und gelöstem Sauerstoff (DO)72,73 verwendet.

Die Minitab-Software wurde zur Entwicklung von PBD für das Screening unabhängiger Faktoren und Design Expert für den Entwurf eines CCD für die Optimierung unabhängiger Faktoren74,75 verwendet. Ein Tukey-HSD-Test wurde durchgeführt, um die Signifikanzvariation auf dem Niveau p < 0,05 mithilfe der ANOVA in R76 zu untersuchen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken dem gesamten Team von Apex Biofertilizers & Biopesticides Limited, Gobindaganj-5740, Gaibandha, Bangladesch und Apex Biotechnology Laboratory, Apex HoldingsLtd., East Chandora, Shafipur, Kaliakoir, Gazipur 1751, Bangladesch für die Durchführung von Laborexperimenten und die Umsetzung vor Ort Experimente.

Diese Studie wurde von Apex Biofertilizers & Biopesticides Limited, Gobindaganj-5740, Gaibandha, Bangladesch und Apex Biotechnology Laboratory, Apex Holdings Ltd., East Chandora, Shafipur, Kaliakoir, Gazipur 1751, Bangladesch, unterstützt.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Md. Abuhena, Jubair Al-Rashid und Md. Faisal Azim.

Abteilung für Forschung und Entwicklung, Apex Biofertilizers and Biopesticides Limited, Gobindaganj, Gaibandha, 5740, Bangladesch

DR. Abuhena, Jubair Al-Rashid, Md. Faisal Azim, MD. Golam Kabir und Noorain Munim Rasul

Apex Biotechnology Laboratory, Apex Holdings Ltd., East Chandora, Shafipur, Kaliakoir, Gazipur, 1751, Bangladesch

Jubair Al-Rashid, MD. Niuz Morshed Khan, Md. Golam Kabir, Nirmal Chandra Barman und Noorain Munim Rasul

Abteilung für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie, College of BioNano Technology, Gachon University, Seongnam, 461-701, Republik Korea

Shahina-Schauspieler

Abteilung für Lebensmittel und Ernährung, Hochschule für Biotechnologie und natürliche Ressourcen, Chung-Ang-Universität, Anseong, Gyeonggi-do, 17546, Republik Korea

Md. Amdadul Huq

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MA, JA-R. und MFA: Konzeptualisierung der Forschungsarbeit, Betrieb der Fermentationsanlage, Datenerfassung, Durchführung der experimentellen Forschungsarbeit, statistische Analyse, Manuskripterstellung, Manuskriptrevision und Bearbeitung. MNMK, MGK und NCB: Datenerfassung, Durchführung der experimentellen Forschungsarbeit. NMR: Manuskripterstellung, Überprüfung, Bearbeitung und Genehmigung des Protokolls. SA: Manuskriptprüfung, Bearbeitung und Genehmigung des Protokolls. MAH: Manuskripterstellung, Überprüfung, Bearbeitung, Genehmigung des Protokolls und Einreichung des Manuskripts. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Md. Faisal Azim, Shahina Akter oder Md. Amdadul Huq.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Abuhena, M., Al-Rashid, J., Azim, MF et al. Optimierung der industriellen (3000 L) Produktion von Bacillus subtilis CW-S und seine neuartige Anwendung für den Miniknollen- und industriellen Kartoffelanbau. Sci Rep 12, 11153 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15366-5

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Eingegangen: 02. März 2022

Angenommen: 09. Mai 2022

Veröffentlicht: 01. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15366-5

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